La proteína elegida para realizar el trabajo con ella es la aldehído deshidrogenasa, cuya secuencia se localiza entre los nucleótidos 12960-14726. la secuencia de la proteína es la siguiente ; (la secuencia de DNA que codifica la proteína elegida es:
La secuencia de aminoácidos es la siguiente (FASTA); MTEQLGRQSTSTSTDPKSDDHTFASLDPRNDSVVAQHPIADQQEIEKAVAAARTASKWWDQLGFQGRRKVLGNFRAAIATHAESMAAIISAETGKPSDDALLEVMLAVEHLDWAARNAQKVLRRRRVGAGLISANQSASVGYRPMGVVGVIGPWNYPLYTPMGSIGYALAAGNAVVFKPSELSPGVGVELARLWNIAAPGHPVLQTITGD GKTGALLCSSGVDKIAFTGSTATAKRVMAACADTLTPLVAECGGKDAMLVDSDANLDAAVSFAAFGAVGNGGQTCAGVERIYVAAPVYDAFLSKLTAALRDAHAGATDSSTYGPMTLGKQTAIVRGQIEDALSRGAKAVLGGLDSFNGPFIDPIILTDVPEDSTAITEETFGPSVVVNKVTDMNEGIERANASKYGLGASVFTKSSSKGR AIAEKLECGVVTVNSVLGFAGIAALPFGGVGDSGFGRIHGADGLREFSSVKSLAVQKFSAPLDLLTIERKARDMKISRWMLAKRHAKS
La peroxidación lipídica puede causar daños celulares irreparables, que si no se palian a tiempo inducen la apoptosis (Yang et al., 2001). Algunos de los sistemas que sirver para proteger contra los productos que se generan por el estrés oxidativo son la aldehído deshidrogenasa, la alcohol deshidrogenasa, la aldo-ceto reductasa, las GPx dependientes de selenio y las GST (Hayes et al., 2005). Hay varias Aldehído deshidrogenasa, se clasifican en función de si son dependientes de NAD+ , NADP+ o ambos, (EC 1.2.1.3: Aldehído deshidrogenasa (NAD+) , EC 1.2.1.4: Aldehído deshidrogenasa (NADP+), EC 1.2.1.5: Aldehído deshidrogenasa (NAD(P)+)). Todas se encargan de oxidar un aldehído a un alcohol. En los microorganismos en los cuales se ha estudiado, forma parte de una ruta de síntesis de un osmoprotector, y es una enzima esencial para el crecimiento del microorganismo.
3 ) Análisis del gen que codifica para la proteína elegida.
diseño de primers para la amplificación del gen por PCR.
Se utilizó el programa Primer3Mangemer, la primera pareja de primers que ofrecía el programa fue la siguiente. No hay que utilizar programa.
left --> ACTCTACTGCAAGCGCCACT
Inicio en nt 794 , longitud 20 pb, Tm 60.2 ºC , GC 55%
right --> AGAGCTGTGGCCAGTACCAG
Inicio en nt 945, longitud 20 pb, Tm 60.5 ºC , GC 60%
Está segura que esos primers amplifican el gen??
interrupción génica por PCR
Para comprobar si el gen es esencial para la bacteria se puede clonar un fragmento interno del gen en un plásmido suicida, con el que después se transformaría al microorganismo. Una vez producida la recombinación entre el plásmido y la bacteria, en el genoma de la bacteria quedaría el gen incompleto, si la bacteria crece significa que el gen no es esencial, pero si no crece es porque se produjo una interrupción génica de un gen esencial. También se puede deleccionar un fragmento del gel por PCR, para los cuál se usaran 4 primer dos externos y dos internos ;
Primer 1 rojo
Primer 2 azul
Primer 3 rosa
Primer 4 verde
Se produce una deleción de un fragmento interno del gen, como la secuencia seleccionada se encuentra en marco, la deleción no afecta al resto de genes que se localicen aguas abajo de este.
4 ) Análisis de la proteína elegida.
diseño de primers para una rápida purificación mediante colas de histidina.
Primer 2 CGCCGCCGCCGCCGCCGCCTCGACATCATGCCTCCGTCGCGGG (en morado está la cola de histidinas para una rápida purificación y en rosa está el sitio de corte para poder quitar las colas de histidina de la proteína una vez purificada). No se puede poner un sitio de corte de DNA para cortar una proteína. No lo ha entendido
estudio de la proteína por bioinformática
508 aminoácidos, pm = 53025.2, pI = 7.09
composición de aminoácidos
Ala 14.4 %
Arg 5.1 %
Asn 2.8%
Asp 5.9%
Cys 1%
Gln 2.8%
Glu 4.1%
Gly 10.2 %
Hys 1.6%
Ile 4.7 %
Leu 7.9 %
Lis 4.9%
Met 2.2%
Phe 3.3 %
Pro 4.1 %
Ser 8.1 %
Thr 6.1 %
Trp 1.2 %
Tyr 1.6%
Val 8.1%
No presenta coiled-coils, ni dominios transmembrana
mutagénesis in vitro (proqué ha elegido ese cambio????)
El aminoácido que vamos a mutar en una serina (marcado en rosa) y lo vamos a cambiar por una arginina cuyo codón sería AGG, para ello vamos realizar la mutación en un plásmido, y sólo necesitaremos dos primers ; Primer 1 GACCTCGACGTCGAGGGCGGCAAGGTCCG Primer 2 CGGACCTTGCCGCCCTCGACGTCGAGGTC
GCACACTCGTGGCCCGCGCGACCATGACCGGTGTCGAGACCGCCCGACCCGCGACGGAGGCATGAT 486 CGTGTGAGCACCGGGCGCGCTGGTACTGGCCACAGCTCTGGCGGGCTGGGCGCTGCCTCCGTACTA 486
Primer 1 GCCCGACCCCTCGACCGAACCACATTCC Primer 2 CCTTTACTCATATCATGCCTCCGTCGCGGG Primer 3 GGCATGATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGG
Primer 4 TTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTG
Bibliografía
Hayes, J. D., Flanagan, J. U. y Jowsey, I. R. 2005. Glutathione transferases. Annu Rev
Pharmacol Toxicol 45: 51-88 Hayes, J. D., Flanagan, J. U. y Jowsey, I. R. 2005. Glutathione transferases. Annu Rev Pharmacol Toxicol 45: 51-88
Yang, Y., Cheng, J. Z., Singhal, S. S., Saini, M., Pandya, U. et al.,. 2001. Role of glutathione Stransferases in protection against lipid peroxidation. Overexpression of hGSTA2-2 in K562 cells protects against hydrogen peroxide-induced apoptosis and inhibits JNK and caspase 3 activation. J Biol Chem 276: 19220-19230
Además de esta bibliografía se utilizaron los programas informáticos de las prácticas de la asignatura.
El trabajo no se ha escrito tal como se pedía. Poca bibliografía.
1) Microorganismo del cual procede la secuencia .
El microorganismo del cual procede la secuencia pertenece al género Rhodococcus .(géneros en cursiva)
2) Análisis informático de la secuencia.
Los ORFs localizados por el programa ARTEMIS, en la secuencia de 17.000 pb, son los siguientes ;
La proteína elegida para realizar el trabajo con ella es la aldehído deshidrogenasa, cuya secuencia se localiza entre los nucleótidos 12960-14726. la secuencia de la proteína es la siguiente ; (la secuencia de DNA que codifica la proteína elegida es:
En doble hélice ;
GCCCGACCCCTCGACCGAACCACATTCCTGGAGAGAACATGGCAAACGCAGACGCTGTCGGAGTCGAGGG 0 CGGGCTGGGGAGCTGGCTTGGTGTAAGGACCTCTCTTGTACCGTTTGCGTCTGCGACAGCCTCAGCTCCC 0
CGTGCCGTTCGACCTCGACGTCGAGCGCGGCAAGGTCCGCGAATTCGCGAAGGCGACGCACTCGACCAAC 70 GCACGGCAAGCTGGAGCTGCAGCTCGCGCCGTTCCAGGCGCTTAAGCGCTTCCGCTGCGTGAGCTGGTTG 70
CCCGACTACTCCGAGCGCGAGGACGCGGTGTCCCCACCGACCTTCCTCACCACCACCCTGCACTGGCAGC 140 GGGCTGATGAGGCTCGCGCTCCTGCGCCACAGGGGTGGCTGGAAGGAGTGGTGGTGGGACGTGACCGTCG 140
CGCCGGAGGGAAACCCCTGGAAGGCTGTGGAACTCGACGGCAAGCGTGGTTTGCACGCCGAGCAGCAGTA 210 GCGGCCTCCCTTTGGGGACCTTCCGACACCTTGAGCTGCCGTTCGCACCAAACGTGCGGCTCGTCGTCAT 210
CGAGTTCTTCGGCCCCCCGCCGAAGGCCGGCACGCGCCTGCGGTGCACCTCCCGGATCACCGACGTCTAC 280 GCTCAAGAAGCCGGGGGGCGGCTTCCGGCCGTGCGCGGACGCCACGTGGAGGGCCTAGTGGCTGCAGATG 280
ACCAAGCAGGGCGGGCGCGGCGGTGAGATGACGTTCGCGGTGATGGTCACCGACTTCGTCGACTCCACAG 350 TGGTTCGTCCCGCCCGCGCCGCCACTCTACTGCAAGCGCCACTACCAGTGGCTGAAGCAGCTGAGGTGTC 350
GCACACTCGTGGCCCGCGCGACCATGACCGGTGTCGAGACCGCCCGACCCGCGACGGAGGCATGAT 486 CGTGTGAGCACCGGGCGCGCTGGTACTGGCCACAGCTCTGGCGGGCTGGGCGCTGCCTCCGTACTA 486
La secuencia de aminoácidos es la siguiente (FASTA);
MTEQLGRQSTSTSTDPKSDDHTFASLDPRNDSVVAQHPIADQQEIEKAVAAARTASKWWDQLGFQGRRKVLGNFRAAIATHAESMAAIISAETGKPSDDALLEVMLAVEHLDWAARNAQKVLRRRRVGAGLISANQSASVGYRPMGVVGVIGPWNYPLYTPMGSIGYALAAGNAVVFKPSELSPGVGVELARLWNIAAPGHPVLQTITGD GKTGALLCSSGVDKIAFTGSTATAKRVMAACADTLTPLVAECGGKDAMLVDSDANLDAAVSFAAFGAVGNGGQTCAGVERIYVAAPVYDAFLSKLTAALRDAHAGATDSSTYGPMTLGKQTAIVRGQIEDALSRGAKAVLGGLDSFNGPFIDPIILTDVPEDSTAITEETFGPSVVVNKVTDMNEGIERANASKYGLGASVFTKSSSKGR AIAEKLECGVVTVNSVLGFAGIAALPFGGVGDSGFGRIHGADGLREFSSVKSLAVQKFSAPLDLLTIERKARDMKISRWMLAKRHAKS
La peroxidación lipídica puede causar daños celulares irreparables, que si no se palian a tiempo inducen la apoptosis (Yang et al., 2001). Algunos de los sistemas que sirver para proteger contra los productos que se generan por el estrés oxidativo son la aldehído deshidrogenasa, la alcohol deshidrogenasa, la aldo-ceto reductasa, las GPx dependientes de selenio y las GST (Hayes et al., 2005). Hay varias Aldehído deshidrogenasa, se clasifican en función de si son dependientes de NAD+ , NADP+ o ambos, (EC 1.2.1.3: Aldehído deshidrogenasa (NAD+) , EC 1.2.1.4: Aldehído deshidrogenasa (NADP+), EC 1.2.1.5: Aldehído deshidrogenasa (NAD(P)+)). Todas se encargan de oxidar un aldehído a un alcohol. En los microorganismos en los cuales se ha estudiado, forma parte de una ruta de síntesis de un osmoprotector, y es una enzima esencial para el crecimiento del microorganismo.
3 ) Análisis del gen que codifica para la proteína elegida.
Se utilizó el programa Primer3Mangemer, la primera pareja de primers que ofrecía el programa fue la siguiente. No hay que utilizar programa.
left --> ACTCTACTGCAAGCGCCACT
Inicio en nt 794 , longitud 20 pb, Tm 60.2 ºC , GC 55%
right --> AGAGCTGTGGCCAGTACCAG
Inicio en nt 945, longitud 20 pb, Tm 60.5 ºC , GC 60%
Está segura que esos primers amplifican el gen??
- interrupción génica por PCR
Para comprobar si el gen es esencial para la bacteria se puede clonar un fragmento interno del gen en un plásmido suicida, con el que después se transformaría al microorganismo. Una vez producida la recombinación entre el plásmido y la bacteria, en el genoma de la bacteria quedaría el gen incompleto, si la bacteria crece significa que el gen no es esencial, pero si no crece es porque se produjo una interrupción génica de un gen esencial. También se puede deleccionar un fragmento del gel por PCR, para los cuál se usaran 4 primer dos externos y dos internos ;GCCCGACCCCTCGACCGAACCACATTCCTGGAGAGAACATGGCAAACGCAGACGCTGTCGGAGTCGAGGG 0
CGGGCTGGGGAGCTGGCTTGGTGTAAGGACCTCTCTTGTACCGTTTGCGTCTGCGACAGCCTCAGCTCCC 0
CGTGCCGTTCGACCTCGACGTCGAGCGCGGCAAGGTCCGCGAATTCGCGAAGGCGACGCACTCGACCAAC 70 GCACGGCAAGCTGGAGCTGCAGCTCGCGCCGTTCCAGGCGCTTAAGCGCTTCCGCTGCGTGAGCTGGTTG 70
CCCGACTACTCCGAGCGCGAGGACGCGGTGTCCCCACCGACCTTCCTCACCACCACCCTGCACTGGCAGC 140 GGGCTGATGAGGCTCGCGCTCCTGCGCCACAGGGGTGGCTGGAAGGAGTGGTGGTGGGACGTGACCGTCG 140
CGCCGGAGGGAAACCCCTGGAAGGCTGTGGAACTCGACGGCAAGCGTGGTTTGCACGCCGAGCAGCAGTA 210 GCGGCCTCCCTTTGGGGACCTTCCGACACCTTGAGCTGCCGTTCGCACCAAACGTGCGGCTCGTCGTCAT 210
CGAGTTCTTCGGCCCCCCGCCGAAGGCCGGCACGCGCCTGCGGTGCACCTCCCGGATCACCGACGTCTAC 280 GCTCAAGAAGCCGGGGGGCGGCTTCCGGCCGTGCGCGGACGCCACGTGGAGGGCCTAGTGGCTGCAGATG 280
ACCAAGCAGGGCGGGCGCGGCGGTGAGATGACGTTCGCGGTGATGGTCACCGACTTCGTCGACTCCACAG 350 TGGTTCGTCCCGCCCGCGCCGCCACTCTACTGCAAGCGCCACTACCAGTGGCTGAAGCAGCTGAGGTGTC 350
GCACACTCGTGGCCCGCGCGACCATGACCGGTGTCGAGACCGCCCGACCCGCGACGGAGGCATGAT 486 CGTGTGAGCACCGGGCGCGCTGGTACTGGCCACAGCTCTGGCGGGCTGGGCGCTGCCTCCGTACTA 486
Primer 1 rojo
Primer 2 azul
Primer 3 rosa
Primer 4 verde
Se produce una deleción de un fragmento interno del gen, como la secuencia seleccionada se encuentra en marco, la deleción no afecta al resto de genes que se localicen aguas abajo de este.
4 ) Análisis de la proteína elegida.
- diseño de primers para una rápida purificación mediante colas de histidina.
GCCCGACCCCTCGACCGAACCACATTCCTGGAGAGAACATGGCAAACGCAGACGCTGTCGGAGTCGAGGG 0 CGGGCTGGGGAGCTGGCTTGGTGTAAGGACCTCTCTTGTACCGTTTGCGTCTGCGACAGCCTCAGCTCCC 0CGTGCCGTTCGACCTCGACGTCGAGCGCGGCAAGGTCCGCGAATTCGCGAAGGCGACGCACTCGACCAAC 70 GCACGGCAAGCTGGAGCTGCAGCTCGCGCCGTTCCAGGCGCTTAAGCGCTTCCGCTGCGTGAGCTGGTTG 70
CCCGACTACTCCGAGCGCGAGGACGCGGTGTCCCCACCGACCTTCCTCACCACCACCCTGCACTGGCAGC 140 GGGCTGATGAGGCTCGCGCTCCTGCGCCACAGGGGTGGCTGGAAGGAGTGGTGGTGGGACGTGACCGTCG 140
CGCCGGAGGGAAACCCCTGGAAGGCTGTGGAACTCGACGGCAAGCGTGGTTTGCACGCCGAGCAGCAGTA 210 GCGGCCTCCCTTTGGGGACCTTCCGACACCTTGAGCTGCCGTTCGCACCAAACGTGCGGCTCGTCGTCAT 210
CGAGTTCTTCGGCCCCCCGCCGAAGGCCGGCACGCGCCTGCGGTGCACCTCCCGGATCACCGACGTCTAC 280 GCTCAAGAAGCCGGGGGGCGGCTTCCGGCCGTGCGCGGACGCCACGTGGAGGGCCTAGTGGCTGCAGATG 280
ACCAAGCAGGGCGGGCGCGGCGGTGAGATGACGTTCGCGGTGATGGTCACCGACTTCGTCGACTCCACAG 350 TGGTTCGTCCCGCCCGCGCCGCCACTCTACTGCAAGCGCCACTACCAGTGGCTGAAGCAGCTGAGGTGTC 350
GCACACTCGTGGCCCGCGCGACCATGACCGGTGTCGAGACCGCCCGACCCGCGACGGAGGCATGAT 486 CGTGTGAGCACCGGGCGCGCTGGTACTGGCCACAGCTCTGGCGGGCTGGGCGCTGCCTCCGTACTA 486
508 aminoácidos, pm = 53025.2, pI = 7.09
composición de aminoácidos
Ala 14.4 %
Arg 5.1 %
Asn 2.8%
Asp 5.9%
Cys 1%
Gln 2.8%
Glu 4.1%
Gly 10.2 %
Hys 1.6%
Ile 4.7 %
Leu 7.9 %
Lis 4.9%
Met 2.2%
Phe 3.3 %
Pro 4.1 %
Ser 8.1 %
Thr 6.1 %
Trp 1.2 %
Tyr 1.6%
Val 8.1%
No presenta coiled-coils, ni dominios transmembrana
GCCCGACCCCTCGACCGAACCACATTCCTGGAGAGAACATGGCAAACGCAGACGCTGTCGGAGTCGAGGG 0 CGGGCTGGGGAGCTGGCTTGGTGTAAGGACCTCTCTTGTACCGTTTGCGTCTGCGACAGCCTCAGCTCCC 0
CGTGCCGTTCGACCTCGACGTCGAGCGCGGCAAGGTCCGCGAATTCGCGAAGGCGACGCACTCGACCAAC 70 GCACGGCAAGCTGGAGCTGCAGCTCGCGCCGTTCCAGGCGCTTAAGCGCTTCCGCTGCGTGAGCTGGTTG 70
CCCGACTACTCCGAGCGCGAGGACGCGGTGTCCCCACCGACCTTCCTCACCACCACCCTGCACTGGCAGC 140 GGGCTGATGAGGCTCGCGCTCCTGCGCCACAGGGGTGGCTGGAAGGAGTGGTGGTGGGACGTGACCGTCG 140
CGCCGGAGGGAAACCCCTGGAAGGCTGTGGAACTCGACGGCAAGCGTGGTTTGCACGCCGAGCAGCAGTA 210 GCGGCCTCCCTTTGGGGACCTTCCGACACCTTGAGCTGCCGTTCGCACCAAACGTGCGGCTCGTCGTCAT 210
CGAGTTCTTCGGCCCCCCGCCGAAGGCCGGCACGCGCCTGCGGTGCACCTCCCGGATCACCGACGTCTAC 280 GCTCAAGAAGCCGGGGGGCGGCTTCCGGCCGTGCGCGGACGCCACGTGGAGGGCCTAGTGGCTGCAGATG 280
ACCAAGCAGGGCGGGCGCGGCGGTGAGATGACGTTCGCGGTGATGGTCACCGACTTCGTCGACTCCACAG 350 TGGTTCGTCCCGCCCGCGCCGCCACTCTACTGCAAGCGCCACTACCAGTGGCTGAAGCAGCTGAGGTGTC 350
GCACACTCGTGGCCCGCGCGACCATGACCGGTGTCGAGACCGCCCGACCCGCGACGGAGGCATGAT 486 CGTGTGAGCACCGGGCGCGCTGGTACTGGCCACAGCTCTGGCGGGCTGGGCGCTGCCTCCGTACTA 486
El aminoácido que vamos a mutar en una serina (marcado en rosa) y lo vamos a cambiar por una arginina cuyo codón sería AGG, para ello vamos realizar la mutación en un plásmido, y sólo necesitaremos dos primers ;
Primer 1 GACCTCGACGTCGAGGGCGGCAAGGTCCG
Primer 2 CGGACCTTGCCGCCCTCGACGTCGAGGTC
GCCCGACCCCTCGACCGAACCACATTCCTGGAGAGAACATGGCAAACGCAGACGCTGTCGGAGTCGAGGG 0 CGGGCTGGGGAGCTGGCTTGGTGTAAGGACCTCTCTTGTACCGTTTGCGTCTGCGACAGCCTCAGCTCCC 0
CGTGCCGTTCGACCTCGACGTCGAGCGCGGCAAGGTCCGCGAATTCGCGAAGGCGACGCACTCGACCAAC 70 GCACGGCAAGCTGGAGCTGCAGCTCGCGCCGTTCCAGGCGCTTAAGCGCTTCCGCTGCGTGAGCTGGTTG 70
CCCGACTACTCCGAGCGCGAGGACGCGGTGTCCCCACCGACCTTCCTCACCACCACCCTGCACTGGCAGC 140 GGGCTGATGAGGCTCGCGCTCCTGCGCCACAGGGGTGGCTGGAAGGAGTGGTGGTGGGACGTGACCGTCG 140
CGCCGGAGGGAAACCCCTGGAAGGCTGTGGAACTCGACGGCAAGCGTGGTTTGCACGCCGAGCAGCAGTA 210 GCGGCCTCCCTTTGGGGACCTTCCGACACCTTGAGCTGCCGTTCGCACCAAACGTGCGGCTCGTCGTCAT 210
CGAGTTCTTCGGCCCCCCGCCGAAGGCCGGCACGCGCCTGCGGTGCACCTCCCGGATCACCGACGTCTAC 280 GCTCAAGAAGCCGGGGGGCGGCTTCCGGCCGTGCGCGGACGCCACGTGGAGGGCCTAGTGGCTGCAGATG 280
ACCAAGCAGGGCGGGCGCGGCGGTGAGATGACGTTCGCGGTGATGGTCACCGACTTCGTCGACTCCACAG 350 TGGTTCGTCCCGCCCGCGCCGCCACTCTACTGCAAGCGCCACTACCAGTGGCTGAAGCAGCTGAGGTGTC 350
GCACACTCGTGGCCCGCGCGACCATGACCGGTGTCGAGACCGCCCGACCCGCGACGGAGGCATGAT 486 CGTGTGAGCACCGGGCGCGCTGGTACTGGCCACAGCTCTGGCGGGCTGGGCGCTGCCTCCGTACTA 486
Primer 1 GCCCGACCCCTCGACCGAACCACATTCC
Primer 2 CCTTTACTCATATCATGCCTCCGTCGCGGG
Primer 3 GGCATGATATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGG
Primer 4 TTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTG
Bibliografía
Hayes, J. D., Flanagan, J. U. y Jowsey, I. R. 2005. Glutathione transferases. Annu Rev
Pharmacol Toxicol 45: 51-88 Hayes, J. D., Flanagan, J. U. y Jowsey, I. R. 2005. Glutathione transferases. Annu Rev Pharmacol Toxicol 45: 51-88
Yang, Y., Cheng, J. Z., Singhal, S. S., Saini, M., Pandya, U. et al.,. 2001. Role of glutathione Stransferases in protection against lipid peroxidation. Overexpression of hGSTA2-2 in K562 cells protects against hydrogen peroxide-induced apoptosis and inhibits JNK and caspase 3 activation. J Biol Chem 276: 19220-19230
Además de esta bibliografía se utilizaron los programas informáticos de las prácticas de la asignatura.